为初级大脑神经元开发了强大和特定的基因调节工具

一种强大的新工具可用于神经科学研究大脑发育、记忆和学习机制，以及大脑失调在成瘾、抑郁、精神分裂症和阿尔茨海默病等神经精神疾病中的作用。

这种分子生物学工具是由阿拉巴马大学伯明翰分校的研究人员开发和验证的，能够选择性地和强有力地打开基因在神经元。它被传递到在培养皿中生长的神经元中，更重要的是，它也被传递到大脑活体成年大鼠的神经元。该工具可以增加表达式单个基因或多个基因同时表达，且增加的基因表达量可以控制。

这种增加基因表达的选择性能力——这意味着基因产生更多编码蛋白质的mRNA——使研究人员能够查询单个基因或基因组的作用。

这些问题是研究发育过程中不同基因程序的表达如何控制大脑生长、连接和神经元类型的基石。对于成人大脑来说，该工具可以帮助解释由神经活动和行为经验改变的基因程序如何导致适应性行为。该工具还可以帮助研究基因程序的失调-其中许多与神经精神疾病有关-发生在大脑发育或者在发育完全的成人大脑中。

该工具使用了著名的基于crispr的技术，该技术被包装成慢病毒，以稳定地引入神经元。

“基于crispr的技术为检查基因功能提供了新的途径，但在有丝分裂后神经元中转基因表达的困难推迟了这些工具在临床中的应用中枢神经系统UAB研究团队的负责人杰里米·戴博士说。“在这里，我们展示了一种高效、神经元优化的双慢病毒crispr转录激活系统，能够实现稳健、模块化和可调的基因诱导和多路复用基因调控在几个主要的啮齿动物神经元培养系统中。”

戴是UAB医学院神经生物学系的助理教授，也是UAB Civitan国际研究中心的科学家。这项研究发表在该杂志上eNeuroKatherine E. Savell和Svitlana V. Bach博士，UAB神经生物学系，作为共同第一作者。

“随着CRISPR技术的发展，我们能够根据需要选择性地编辑基因和基因表达水平，”范德比尔特大学范德比尔特大脑研究所的助理教授艾琳·卡利帕里博士说，她没有参与这项研究。“这为将基因表达和基因调控的影响与细胞功能和行为联系起来提供了一个强大的新工具;但到目前为止，这些系统主要是为细胞培养而优化的。”

卡利帕里说:“虽然这听起来微不足道，但将一种基因工具从培养到体内使用是非常困难的。这项技术将彻底改变这些系统在体内的使用，以便将特定大脑区域中特定基因的转录调节因子的变化与神经活动和行为联系起来。此外，这些工具将允许在清醒和有行为的动物身上，对特定区域的单个基因或基因组进行操作，这将给我们一个前所未有的视角来了解基因的作用基因表达在的行为。”

“了解控制这一过程的基本机制，”她说，“是开发精神疾病选择性治疗的第一步。”

研究细节

CRISPR/Cas9系统被广泛称为分子剪刀，可以在基因组中的精确位置进行切割，以删除或添加基因。一种不能切割DNA的非活性形式的CRISPR/Cas9可以与转录效应物结合，在精确的位置激活基因的表达。戴和同事们使用了这个被称为CRISPRa的系统。他们将其包装成慢病毒，使CRISPR机制能够稳定表达，使研究人员能够测试其调节神经元基因的能力。该系统包括一个带有激活剂的crispr -缺陷- cas9和一个引导RNA，引导CRISPR-dCas9到达基因组上的精确点。

在神经元中使用CRISPRa的一个局限性是，在其他类型的细胞中通常用于驱动分子机制的启动子在驱动神经元中的CRISPR表达时无效。为了避免这种情况，UAB的研究人员根据人类突触素(SYN)基因的启动子序列选择了一种神经元特异性启动子，以在神经元中表达他们的CRISPRa工具。随后，UAB的研究人员开发了CRISPR单导向rna，将该系统定位于一系列不同的基因，从小的转录因子到大的细胞外蛋白。他们表明，该系统在大鼠大脑皮层、海马体和纹状体的初级神经元中显著诱导了这些基因靶点的表达。

使用多个单一引导rna，称为多路复用，允许单个基因的可调上调，或多个基因的协调上调。

UAB团队还在一个非常复杂的大脑基因上测试了该系统，即脑源性神经营养因子(Bdnf)。Bdnf由于其复杂的转录调控而极其难以研究，但它在神经元分化和生存、树突生长、突触发育、长期增强和记忆形成等多种过程中起着重要的核心作用。Bdnf有9个不同的启动子位置，每一个都导致一个不同的mRNA转录本。

“由于这种复杂性，试图描述单个Bdnf mrna在疾病中的不同功能作用神经元已经产生了相互矛盾的结果，目前可用的工具要么缺乏选择性上调单个Bdnf转录变异的能力，要么需要繁琐的分子克隆协议来生成基因特异性靶向结构，”Day说。

Day和同事们能够使用他们的CRISPR-dCas9系统专门针对Bndf上两个不同位点的单个启动子。每个基因只诱导该位点的转录本，而不改变任何其他启动子的表达。然后，他们描述了由每个独特的转录本诱导的下游差异表达基因，并测量了神经元生理学的伴随变化。

最后，研究人员在成年大鼠身上验证了他们的基因调控系统，他们使用立体定向手术将携带crispra的慢病毒注入大脑的前额皮质、海马体和伏隔核。

普林斯顿神经科学研究所助理教授凯瑟琳·詹森(Catherine Jensen Peña)博士说:“我认为我们只是刚刚开始触及基因调控类型的表面，现在通过产生像这样的效应剂耦合dCas9工具是可能的。”她没有参与这项研究。“这为神经科学打开了令人兴奋的可能性，特别是在研究大脑功能和大脑疾病的复杂性方面。”