2022年4月12日,功能

艾滋病毒测序前病毒从人们使用droplet-microfluidics抗逆转录病毒治疗

由Thamarasee Jeewandara、医疗Xpbob游戏ress

艾滋病毒测序前病毒从人们使用droplet-microfluidics抗逆转录病毒治疗
应用SIP-seq ART-treated个人。(a)在艺术研究艾滋病毒的持久性,CD4 + T细胞由参与者的取样检测不到病毒载量的等离子体。(b) CD4 + t细胞DNA样本与SIP-seq处理生成单前病毒测序库。提取基因组DNA (gDNA)和区分滴。DNA是MDA-amplified在每个液滴,其次是PCR检测和排序的艾滋病毒阳性滴。每个排序滴编码的DNA测序。(c)序列数据被映射到一个参考艾滋病毒基因组的同时测定单个病毒基因组和集成网站(是)。信贷:自然生物医学工程(2022)。DOI: 10.1038 / s41551 - 022 - 00864 - 8

人类免疫学病毒(HIV)的感染发生通过整合其基因组到感染细胞进入一个可逆的非活动状态延迟,避开抗逆转录病毒疗法。序列的能力这样的前病毒和相邻的主机连接在单个细胞可以强调他们在感染细胞的作用机制和持久性。然而,这个实验是很难执行由于高1.5亿倍的背景人类DNA。现在发表在一份新报告自然生物医学工程陈,太阳和一个研究小组在生物工程和病毒持久性和动力学研究的加州大学,旧金山,NIH和陈扎克伯格Biohub,在美国,showed how full-length proviruses are connected to the HIV-host DNA junctions via high-throughput microfluidic assays, for droplet-based whole genome amplification of HIV DNA in its native context. The team conducted a polymerase chain reaction (PCR) to tag droplets containing proviruses to sequence and assay infected cells from people with HIV, receiving suppressing antiretroviral therapy at the time to detect and sequence paired proviral genomes and integration sites. The work sought to improve genetic analysis of persistent HIV-infected cell reservoirs.

艾滋病毒治疗的现状和发展的治疗策略

而全世界大约有3700万人感染人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒),治愈仍然未知。病毒的感染机制规定了中央的障碍,还拥有治愈疾病的关键,作为其基因组艾滋病毒整合到感染细胞的基因组。尽管抗逆转录病毒疗法(ART)可以抑制病毒复制到检测不到的水平,防止病情发展获得性免疫缺陷综合症(艾滋病),它缺少活动细胞水库。结果,治疗必须继续无限期地防止病毒反弹和疾病进展。很难解决艾滋病污名,由于终身艺术管理的成本,用有毒的潜力。因此重要的是要消除或抑制艾滋病毒感染细胞水库获得功能性治愈。检查细胞水库的持久性,科学家必须进行配对分析集成网站和完整的前病毒序列。通过建立可靠、节省成本的方法,分离和序列罕见的病毒?,研究人员可以全面描述HIV水库。太阳等开发这种方法描述前病毒和细胞基因组上下文在艾滋病毒水库使用同步集成网站和前病毒测序(SIP-Seq)。

艾滋病毒测序前病毒从人们使用droplet-microfluidics抗逆转录病毒治疗
演示和验证SIP-seq感染艾滋病毒的细胞样本。(a) TaqMan化验针对波尔(绿色)和env(红色)基因SIP-seq用来检测液滴含有艾滋病毒的基因组。相比之下,嵌套PCR扩增near-full-length艾滋病毒基因组,但不能同时恢复基因和侧翼序列。引物结合位点相对于艾滋病毒基因组的示意图显示集成到一个人类基因组。(b) SIP-seq微流体被用来识别艾滋病毒基因组序列和由以下步骤。(我)通过MDA封装和扩增的DNA。一个整除沾EvaGreen可视化。(2)液滴合并是用于添加TaqMan PCR试剂和分泌物PCR。热循环后的荧光图像显示代表下降,表明双阳性,将孤立的排序。(3)滴排序是用于选择双重PCR阳性。 A representative scatter plot of pol (FAM dye) and env (Cy5 dye) intensities is shown. DNA from each sorted drop was processed for sequencing. Scale bars, 100 µm. (c) SIP-seq recapitulated HIV virus genomes and integration sites from a mixture of DNA from two J-Lat cell lines. gDNA from a mixture of the cell lines was processed with shotgun sequencing, sequencing of nested PCR products, and two SIP-seq drops containing either of two J-Lat proviral sequences. Both J-Lat proviruses had a deletion in the nef gene and sequences mapping to the full-length HXB2 genome, so no reads mapped to this region. The pie chart indicates the recovery of genomes from a 50:50 mixture of DNA from the two cell lines. Credit: Nature Biomedical Engineering (2022). DOI: 10.1038/s41551-022-00864-8
击败的可能性:一个方法来恢复单身前病毒基因组

利用全基因组测序放大、太阳等扩大艾滋病毒基因组在本土环境在微流控液滴,然后为测序标记包含原病毒的飞沫。由此产生的方法提供了一个完整的病毒基因组与宿主细胞连接通过一个连续的组装。该方法的速度和效率允许单前病毒基因组的复苏1.5亿倍高背景的DNA。该团队使用SIP-Seq(同时集成网站和前病毒测序)配置文件前病毒人群在各种艺术相关个人理解潜在的HIV水库。当团队关注艾滋病,这种方法适用于不同的病毒入侵宿主的基因组,提供一个通用平台,描述各种感染的基因。

艾滋病毒测序前病毒从人们使用droplet-microfluidics抗逆转录病毒治疗
(a)冰被播种准备参与者CD4 + T细胞每5井和不到一个受感染的细胞培养的克隆扩张。两个冰的测序克隆分别处理不同的技术。(b) SIP-seq检测到一个完整的艾滋病毒基因组整合到一个人类基因组。(c) SIP-seq确定一个集成的艾滋病毒基因组包含一个反向序列和一个大删除包括3′LTR。从未经加工的基因组DNA使用嵌套pcr引物设计的基础上SIP-seq结果证实艾滋病毒基因组(b和c的底部面板)。来源:自然生物医学工程(2022)。DOI: 10.1038 / s41551 - 022 - 00864 - 8

实验

太阳等旨在恢复所有含有艾滋病毒的基因组DNA片段从数以百万计的人口CD4+T细胞单独序列的分子,他们立即相邻路口。团队从细胞中提取DNA片段大封装在微分离集成艾滋病毒基因组。使用多路复用位移放大(MDA),他们流感放大每个基因片段测序获得足够的单前病毒。他们随后通过孤立个体携带HIV病毒的飞沫前病毒,其中每个液滴页码和测序。病毒学家然后映射读数从每个液滴艾滋病毒基因组参考识别集成网站促进明确的信息在病毒基因组的复杂性,及其集成sites-crucial评估细胞的水库。

艾滋病毒测序前病毒从人们使用droplet-microfluidics抗逆转录病毒治疗
SIP-seq艾滋病毒前病毒和侧翼序列的CD4 +细胞直接从被感染的个体。示意图,显示的位置TaqMan PCR探针在艾滋病毒波尔和env,以及嵌套PCR引物的位置用于near-full-length基因组扩增。这里使用的排序是基于波尔只。b, SIP-seq T细胞的DNA来自个人艺术抑制(1和2)。系统发育树生成使用一个~ 500 - bp地区的波尔从每个参与者获得艾滋病毒序列。宿主基因和原病毒方向相对于宿主基因序列表示,除非没有集成网站被确认。每个酒吧代表一个覆盖一个艾滋病毒基因组及其集成的地图网站。c、集成网站青睐在基因的地区,没有偏好的方向相对于宿主基因(i)和扩展克隆被发现(ii)在参与者艺术抑制。d, SIP-seq DNA从捐赠者没有艺术抑制CD4 + T细胞(参与者3刚刚开始艺术和参与者4艺术已暂停)。e,比例的完整和有缺陷的艾滋病毒(i)和扩展克隆(ii)在参与者3和4。 Ψ, packaging signal; MSD, major splice donor. Credit: Nature Biomedical Engineering (2022). DOI: 10.1038/s41551-022-00864-8

检测前病毒SIP-Seq和调节微流体

增加全身前病毒的特异性和防止随机DNA乳沟,太阳等采用双重具体多路复用Taqman PCR目标地区,艾滋病毒基因组。在实验中,他们产生了特定的DNA序列和体积确认艾滋病前病毒复苏。的微流体SIP-Seq设置包含三个设备,包括一个液滴encapsulator,合并和分选机。科学家把人类基因组DNA片段与多个位移放大(MDA)试剂来封装100亿DNA片段,逼近75年kbp的长度,2000万年独立的水滴,在15分钟。每个液滴含有500不同的片段和太阳等孵化在30摄氏度,为非特异性扩增,合并前Taqman PCR试剂。重复这个步骤之后发现艾滋病毒基因组,团队准备测序的管子。

艾滋病毒测序前病毒从人们使用droplet-microfluidics抗逆转录病毒治疗
图表的微流体设备用于:1)封装DNA和MDA试剂孤立的水滴;b)合并MDA与PCR混合液滴滴;个人PCR阳性滴和c)。信贷:自然生物医学工程(2022)。DOI: 10.1038 / s41551 - 022 - 00864 - 8

分析艾滋病前病毒及其基因组景观ART-treated人

阳光下验证等SIP-Seq艾滋病细胞系和分析艾滋病毒抗逆转录病毒治疗的人。在实验中,他们准备细胞通过电镀,CD4休息+刺激T细胞从一个ART-treated人,其次是通过三个方法和体外培养增殖;散弹枪,嵌套PCR和SIP-Seq Taqman调查。SIP-Seq和嵌套PCR取得了优秀的结果,团队专门选择了SIP-Seq感染细胞体内的全部遗传多样性特征。他们按照这个工作描述艾滋病前病毒的基因组景观,它们直接分离CD4 + T细胞被感染的人。结果显示三个克隆支持克隆起源相对于血统先前的研究相同的个体。

前景

研究表明方法如何使陈太阳和他的同事们研究艾滋病毒前病毒比与现有的PCR方法更有效。结果提供了一个综合分析体内的艾滋病病毒的遗传景观特征的储层中突显其作用HIV持久性。现有方法挑战由于稀有和缺乏独特的表面标记来识别潜伏性感染细胞。使用描述SIP-Seq(同步集成网站和前病毒测序)方法,太阳等提供了一种快速、成本效益和可伸缩的过程,它们应用于人们接受(艺术),强调潜在的水库的存在无性生殖细胞扩张。战略在艾滋病毒感染,适用于其它病毒性疾病与集成在他们的生命周期。

进一步探索

深水库“潜伏”病毒是路障艾滋病毒治疗
更多信息:陈太阳et al, Droplet-microfluidics-assisted测序的艾滋病毒前病毒及其集成网站细胞抗逆转录病毒治疗的人,自然生物医学工程(2022)。DOI: 10.1038 / s41551 - 022 - 00864 - 8

凯瑟琳·m·布鲁纳等储层的定量方法来衡量潜在的hiv - 1病毒,自然(2019)。DOI: 10.1038 / s41586 - 019 - 0898 - 8

期刊信息: 自然生物医学工程 ,自然

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引用:艾滋病毒测序前病毒抗逆转录病毒治疗的人使用droplet-microfluidics(2022年4月12日)检索到1 2022年6月从//www.pyrotek-europe.com/news/2022-04-sequencing-hiv-proviruses-people-antiretroviral.html
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